Родился 2 февраля 1934 г. в Тифлисе (Грузинская ССР, ЗСФСР; ныне Тбилиси, Грузия).
В 1952 г. окончил в Тбилиси музыкальное училище по классу скрипки и дирижирования. В 1953-1955 гг. учился на механико-математическом факультете Московского государственного университета им. М. В. Ломоносова, но не окончил его. В 1965 г. с отличием окончил режиссерский факультет Всесоюзного государственного института кинематографии (ныне Всероссийский государственный институт кинематографии им. С. А. Герасимова). Дипломной работой стал документальный фильм "Чугун" о работе металлургического завода.
В 1956-1961 гг. Отар Иоселиани работал ассистентом режиссера и монтажером на киностудии "Грузия-фильм" (Тбилиси), режиссером на Тбилисской студии хроникально-документальных фильмов.
С 1961 г. был режиссером и сценаристом киностудии "Грузия-фильм". В том же году снял художественный фильм "Апрель" о быте молодой семьи. Отар Иоселиани намеревался представить его во ВГИК как дипломную работу, однако решением киностудии "Грузия-фильм" лента была оценена как "творчески несостоятельная", и защита не состоялась. "Апрель" вышел в ограниченный прокат в Грузинской ССР в декабре 1963 г.
Известность режиссеру принесла драма "Листопад" (1966) о работниках винодельческого завода. Главный герой выступает против нарушений, которые происходят с ведома начальства предприятия. Фильм был запрещен к показу в Грузии. Тем не менее, в 1968 г. он был удостоен приза Международной федерации кинопрессы на Каннском фестивале и премии им. Жоржа Садуля Фонда культуры Франции.
Следующий фильм Отара Иоселиани - драма "Жил певчий дрозд" (1970) - пролежал два года на полке. Причина была в том, что власти увидели в центральном персонаже - музыканте - бездельника и тунеядца. Драма "Пастораль" (1976) о жизни в грузинской деревне подверглась критике со стороны председателя Госкино Филиппа Ермаша. В фильме затронуты нехарактерные для советского кино темы, в том числе глубокие противоречия между крестьянами и творческой интеллигенцией. По словам Иоселиани, в ведомстве ему заявили, что он "больше не будет снимать кино", фактически наложив запрет на профессию.
К началу 1980-х гг. конфликт между режиссером и кинематографическим руководством обострился, и он уехал во Францию. Органы государственной власти не препятствовали его выезду за рубеж. В 1984 г. режиссер снял кинопритчу "Фавориты луны", удостоенную спецприза жюри Венецианского кинофестиваля. В 1989 г. аналогичную награду получил следующий фильм Иоселиани - "И стал свет" о жизни сенегальского племени.
В 1992 г. выпустил драму "Охота на бабочек", в 1996 г. - кинокартину "Разбойники. Глава VII" (удостоена специального Гран-при жюри Венецианского кинофестиваля). За ними последовали ленты "Истина в вине!" (1999) и "Утро понедельника" (2002).
В 2006 г. Отар Иоселиани выпустил комедию "Сады осенью", в 2010 г. - фильм "Шантрапа" (получил спецприз жюри международного кинофестиваля в Мар-дель-Плате, Аргентина).
В 2015 г. вышел последний фильм режиссера - "Зимняя песня".
Он также снял документальные ленты "Эускади" (1982) и "Маленький монастырь в Тоскане" (1988), подготовил трехсерийный телепроект "Грузия одна" (1994).
Отар Иоселиани являлся автором или соавтором сценариев большинства своих кинокартин. Он снимал в жанре притчи и предпочитал не приглашать известных актеров, поскольку, по его мнению, зрители должны узнавать в персонажах фильма самих себя.
Был членом Союза кинематографистов РФ и Российской академии кинематографических искусств "Ника".
Народный артист Грузинской ССР (1984).
Отар Иоселиани был награжден орденом Почетного легиона (Франция, 2006).
Лауреат российской кинопремии "Ника" в номинации "Лучшая режиссерская работа" (1999, "Разбойники. Глава VII"), премии "Серебряный медведь" Берлинского кинофестиваля в аналогичной категории (2002, "Утро понедельника"), а также Царскосельской художественной премии (2001).
Отар Иоселиани скончался 17 декабря 2023 г. в Тбилиси на 90-м году жизни. Похоронен на Вакийском кладбище в столице Грузии.
Жизни и творчеству режиссера посвящен документальный фильм Андрея Пашкевича и Олега Нижегородова "Мой друг Отар Иоселиани" (2011).