Родился 30 августа 1860 г. (18 августа 1860 г. по ст. ст.) в небольшом городке Кибарты Августовской (с 1867 г. - Сувалкской) губернии (ныне г. Кибартай, Вилкавишкский район Мариямпольского уезда Литвы) в бедной еврейской семье. Отец - Илья (Эльяшив-Лейб) Абрамович Левитан (1827-1877) - учился на раввина, но вынужден был зарабатывать на жизнь частными уроками и переводами с французского и немецкого языков, впоследствии работал на железной дороге.
В конце 1860-х гг. семья переехала в Москву.
В 1873 г. Исаак Левитан в возрасте 13 лет поступил в Московское училище живописи, ваяния и зодчества, одно из ведущих художественных учебных заведений страны, куда двумя годами ранее был принят его старший брат Авель (Адольф). Учился с Константином Коровиным, Михаилом Нестеровым, Алексеем Степановым. Его первым педагогом стал известный живописец Василий Перов.
В 1875 г. умерла мать Левитана - Бася Гиршевна (Берта Моисеевна), а спустя два года - отец. Училище освободило Авеля и Исаака от оплаты обучения из-за их крайне тяжелого материального положения, а также "за большие успехи в искусстве". Исаак Левитан был принят в пейзажный класс Алексея Саврасова. В конце 1870-х гг. под влиянием последнего стал складываться стиль Левитана, который впоследствии принес ему мировую славу мастера русской пейзажной живописи.
В апреле 1879 г., после покушения на императора Александра II, организованного революционной террористической организацией "Народная воля", правительство ужесточило запрет евреям проживать вне черты их оседлости (территория компактного проживания евреев в Российской империи, существовавшая с 1791 по 1917 г.). Левитаны были высланы из Москвы, и поселились на небольшой даче в подмосковной Салтыковке (окрестности Балашихи). В том же году на ученической выставке пейзаж Левитана "Осенний день. Сокольники" был приобретен коллекционером Павлом Третьяковым.
В 1882 г. из училища был уволен Алексей Саврасов, после чего непродолжительное время Левитан учился у Василия Поленова. Благодаря ему Исаак Левитан познакомился с меценатом Саввой Мамонтовым, что впоследствии, в 1884 г., дало художнику возможность попробовать себя в качестве театрального декоратора (принимал участие в оформлении спектаклей Русской частной оперы Мамонтова).
К периоду учебы в училище относятся работы Исаака Левитана "Перед грозой" (1879), "Дубовая роща. Осень", "Дуб", "Сосны", "Останкино" (все - 1880), "Весной в лесу" (1882), "Бульвар зимой", "Первая зелень. Май", "Вечер на пашне" (все - 1883) и др. Художник также подрабатывал частными уроками, работал над иллюстрациями к еженедельникам.
С 1884 г. картины Левитана экспонировались Товариществом передвижных художественных выставок (Товарищество передвижников). Сам он жил и работал в Саввинской слободе под Звенигородом, где написал, в частности, пейзажи "Последний снег. Саввинская слобода", "Саввинская слобода под Звенигородом" и "Мостик. Саввинская слобода". В апреле того же года педагогический совет решил исключить Исаака Левитана из училища за непосещение занятий, однако спустя несколько месяцев восстановил по его просьбе. Тем не менее Левитан практически не посещал стены Московского училища живописи, ваяния и зодчества. Весной 1885 г. он был выпущен из него с диплом учителя чистописания, звания художника не получил.
В 1885-1887 гг. он жил неподалеку от усадьбы Бабкино (Истринский район, Московская область). Там познакомился с писателем Антоном Чеховым, братом своего сокурсника Николая Чехову по училищу. Между Чеховым и Левитаном установились длительные - на всю жизнь - дружеские отношения. Несмотря на это, в 1892 г. художник собирался вызвать Чехова на дуэль. Причиной стала публикация рассказа "Попрыгунья", прототипами героев которого стали Левитан, Софья Петровна Кувшинникова, с которой у художника был продолжительный роман, и ее супруг врач Дмитрий Павлович Кувшинников.
Весной 1886 г., после перенесенной болезни сердца, Левитан оправился в Крым. Он провел на полуострове более двух месяцев, написал около 60 этюдов и пейзажей, по возвращении организовал выставку своих работ ("Сакля в Алупке", "Ай-Петри", "Татарское кладбище", "У берега моря", "Три сосны" и др.). Все крымские полотна были раскуплены, два из них приобрел для своей коллекции Павел Третьяков. Впоследствии Поленов говорил, что "ни Айвазовский, ни Лагорио, ни Шишкин, ни Мясоедов не дали таких правдивых и характерных изображений Крыма, как Левитан".
Летние сезоны 1888-1890 гг. художник проводил на Волге, в Плесе. Результатом стали около 200 этюдов и картин, которые принесли Левитану широкую известность ("После дождя", "Золотой Плес", "Тихая обитель" и др.). В 1889 г. он закончил пейзаж "Березовая роща", который критики назвали одним из образцов русского импрессионизма.
В 1889-1890 гг. Исаак Левитан впервые совершил поездку в Западную Европу, посетив Францию и Италию. Вскоре после возвращения создал полотно "Тихая обитель" (1890), на которой изобразил Саввино-Сторожевский монастырь в предзакатном свете. Картина, экспонировавшаяся на выставке передвижников, получила высокие оценки художественных критиков. Впоследствии Чехов использовал образ этого полотна в повести "Три года" (1894).
В начале 1890-х гг. Левитан возглавлял пейзажный класс в Училище изящных искусств художника-архитектора Анатолия Гунста.
В марте 1891 г. стал членом Товарищества передвижных художественных выставок.
В сентябре 1892 г. художник как "лицо иудейского вероисповедания" вновь был вынужден покинуть Москву, некоторое время жил в Тверской и Владимирской губерниях. В первой половине 1890-х гг создал своеобразную драматическую трилогию: "У омута", "Владимирка" (обе - 1892) и "Над вечным покоем" (1894).
В 1894 г. врачи диагностировали у Левитана тяжелую болезнь сердца. Он уехал за границу на лечение, был в Австрии, Франции, Италии. В 1894-1895 гг. им были написаны "Март" и "Золотая осень", "Свежий ветер. Волга", ставшие одними из самых известных полотен художника.
Состояние художника ухудшалось, врачи диагностировали у нее нервное заболевание. В 1895 г. он сымитировал самоубийство.
В 1896 г. болезнь сердца обострилась, и Левитан вновь уехал из Москвы. В 1896 г. несколько недель провел в Финляндии, в 1897 г. посетил Австрию, Италию, Швейцарию, Германию.
В 1898 г. Исааку Левитану было присвоено звание академика пейзажной живописи. Он был приглашен преподавателем в Московское училище живописи, ваяния и зодчества. После смерти Павла Третьякова работал в комиссии по увековечиванию памяти мецената.
Зимой 1899 г. уехал в Ялту, где в то же время жил Антон Чехов. По возвращении в Москву, несмотря на тяжелую болезнь, продолжил преподавать в училище. Участвовал в организационных собраниях "Мира искусств" Сергея Дягилева. В числе его последних работ: "Тишина" (1898), "Сумерки", "Лунная ночь", "Сумерки. Стога" (все - 1899), "Летний вечер" "Лесное озеро", "Облако. Перед грозой", "Туман над водой" (все - 1900) и др.
4 августа (22 июля) 1900 г. Исаак Левитан скончался. У него осталось несколько сотен этюдов и набросков и около 40 неоконченных картин, в т. ч. масштабное полотно "Озеро" ("Озеро. Русь"), которое считается главным произведением позднего периода его творчества.
Исаак Левитан был похоронен на старом еврейском кладбище возле Дорогомиловского кладбища Москвы. 22 апреля 1941 г. его прах был перенесен на Новодевичье кладбище.
Летом 1900 г. картины художника с успехом экспонировались на Всемирной выставке в Париже. В 1901 г. члены "Мира искусств" в Москве и Петербурге организовали посмертную выставку работ Левитана, на которой были представлены более 140 его произведений.
Полотна Исаака Левитана хранятся в Государственной Третьяковской галерее, Государственном Русском музее, Плесском государственном историко-архитектурном и художественном музее-заповеднике, в коллекциях других галерей и музеев России, Белоруссии, Украины, Израиля и др., а также в частных собраниях.
В Москве по адресу Большой Трёхсвятительский переулок (бывший Большой Вузовский пер.), д. 1, стр. 2 расположен дом-мастерская художника, где он жил и работал свои последние годы. В г. Плесе Ивановской области действует Дом-музей Исаака Левитана, который входит в состав Плесского государственного историко-архитектурного и художественного музея-заповедника. Улицы, названные именем художника, есть в Москве, Ломоносове (Санкт-Петербург), Твери, Калининграде, Тель-Авиве (Израиль), Киеве (Украина), Алматы (Казахстан).