Родился 9 мая 1981 г. в г. Макеевке Донецкой области Украинской ССР (ныне Донецкая Народная Республика РФ) в семье рабочих Макеевского металлургического завода.
В начале 2000-х гг. учился на факультете "Экономика предприятия" Донбасской национальной академии строительства и архитектуры.
В 1999-2000 гг. проходил службу в батальоне спецназначения Национальной гвардии Украины (быв. Внутренние войска Украины) на территории Крыма.
С 2002 г. совмещал учебу в вузе с работой в дистрибьюторской компании "Солодке життя" (укр. "Сладкая жизнь"; торговля кондитерскими изделиями).
Занимался общественной и политической деятельностью. 15 декабря 2013 г. баллотировался от партии "Мы имеем цель" (укр. "Ми маемо мету") в украинский парламент по округу №94 (Киевская область). Занял 19-е место из 38 с результатом 0,08% голосов избирателей.
После госпереворота на Украине в феврале 2014 г. население юго-восточных областей страны отказалось поддерживать политику новых властей. Весной 2014 г. Денис Пушилин стал одним из лидеров протестного движения русскоязычного населения в Донецкой области.
5 апреля 2014 г. был назначен заместителем т. н. народного губернатора Донецкой области Павла Губарева.
Участвовал в провозглашении 7 апреля 2014 г. Донецкой Народной Республики, стал сопредседателем ее временного правительства.
С 15 мая по 18 июля 2014 г. - председатель президиума Верховного совета ДНР (согласно конституции ДНР, на тот момент высшая должность в республике). Ушел в отставку по собственному желанию.
В качестве сопредседателя Народного фронта Новороссии занимался первыми гуманитарными поставками из России в Донбасс. Был одним из создателей общественного движения "Донецкая Республика", до октября 2017 г. возглавлял его исполнительный комитет.
В 2014-2018 гг. - депутат Народного совета (парламента) ДНР. Был избран на выборах 2 ноября 2014 г. 14 ноября 2014 г. занял пост заместителя председателя Народного совета. 11 сентября 2015 г. был избран председателем парламента ДНР (за - 76 депутатов из 100).
Одновременно с 9 ноября 2014 г. по 11 сентября 2018 г. являлся постоянным полномочным представителем ДНР на переговорах трехсторонней Контактной группы по урегулированию ситуации на Украине в Минске (участники - Украина, Россия и ОБСЕ).
В конце 2017 г. возглавил Русский центр, созданный в Донецке для "усиления процессов интеграции Донбасса с Российской Федерацией в гуманитарных, социальных и культурных аспектах".
7 сентября 2018 г. Народный совет ДНР назначил Дениса Пушилина временно исполняющим обязанности главы республики. Возглавил ДНР после гибели ее первого главы Александра Захарченко.
25 сентября 2018 г. был избран председателем общественного движения "Донецкая республика".
11 ноября 2018 г. Денис Пушилин одержал победу на выборах главы Донецкой Народной Республики, набрав 60,86% голосов избирателей. За его ближайшего соперника, депутата Народного совета ДНР Романа Храменкова, проголосовали 14,28% избирателей. 20 ноября 2018 г. Денис Пушилин вступил в должность. Он выделил три ключевых направления своей работы на посту главы ДНР: борьба с коррупцией, интеграция с Россией, развитие экономики.
23-27 сентября 2022 г. в ДНР состоялся референдум, в ходе которого большинство граждан республики высказались за вхождение региона в состав РФ.
30 сентября 2022 г. в Москве Денис Пушилин принял участие в церемонии подписания договора о принятии ДНР в состав Российской Федерации в качестве ее нового субъекта.
4 октября 2022 г. президент России Владимир Путин назначил Дениса Пушилина врио главы Донецкой Народной Республики. Согласно положениям договора о принятии ДНР в состав России от 30 сентября 2022 г., врио главы будет руководить республикой до вступления в должность избранного главы Донецкой Народной Республики. Выборы должны пройти в соответствии с законодательством РФ.
Член Всероссийской политической партии "Единая Россия" (партийный билет получил 4 декабря 2021 г.). Секретарь регионального отделения партии в Донецкой Народной республике (с 21 октября 2022 г.).
Входит в состав Совета при президенте РФ по развитию местного самоуправления (с апреля 2023 г.).
Награжден орденом "За заслуги перед Отечеством" I степени (2022).
Имеет ордена "За верность долгу" (Республика Крым, РФ; 2018), Кадырова (Чеченская Республика, РФ; 2022), медаль "За мужество и доблесть" (Республика Крым, РФ; 2021).
Женат, имеет трех дочерей.