Родился 18 июля 1921 г. в г. Кембридже, штат Огайо (США). Начальную и среднюю школу окончил в г. Нью-Конкорде того же штата.

С сентября 1939 г. по январь 1942 г. учился в Колледже Маскингама в Нью-Конкорде, но не окончил его и ушел в армию. Степень бакалавра технических наук получил в 1962 г., прослушав курс в Университете Мэриленда.

В марте 1942 г. поступил на службу в ВМС США, став курсантом авиационного училища. По его окончании в 1943 г. был направлен в Корпус морской пехоты США. Служил в 155-й эскадрилье истребителей (Маршалловы острова), на самолетах F-4U совершил 59 боевых вылетов во время Второй мировой войны (1939-1945).
После войны проходил службу в 218-й морской эскадрилье истребителей, которая базировалась на острове Гуам. Участвовал в патрульных полетах над Северным Китаем. В 1948-1950 гг. был летчиком-инструктором на авиабазе Корпус-Кристи в Техасе, затем - в боевой школе самолетов-амфибий в Квантико (штат Вирджиния).
Во время Корейской войны (1950-1953) был летчиком 311-й морской эскадрильи истребителей, выполнил 63 боевых вылета на самолете F-9F. Затем его временно перевели в ВВС США, где Гленн выполнил 27 полетов на истребителе F-86.
В 1953-1954 гг. прошел курс обучения в школе летчиков-испытателей ВМС США в Пэтьюксент-Ривер (штат Мэриленд).
С ноября 1956 г. по апрель 1959 г. служил в отделе конструирования истребителей Управления аэронавтики ВМС США в Вашингтоне (округ Колумбия).
В июле 1957 г. на сверхзвуковом самолете F-8U Crusader Джон Гленн совершил беспосадочный трансконтинентальный перелет из Лос-Анджелеса в Нью-Йорк за 3 ч 23 мин., что на тот момент стало рекордом.
Общий налет Джона Гленна в качестве летчика составил около 9 тыс. часов, в том числе порядка 3 тыс. часов - на реактивных самолетах.
В апреле 1959 г. он был зачислен в первую группу астронавтов Национального управления по аэронавтике и исследованию космического пространства США (НАСА, NASA), в которую входили еще шесть человек.
В составе отряда готовился к полету по программе Mercury ("Меркурий"). Гленн был приписан к специальному космическому отделу НАСА в Исследовательском центре Лэнгли в Хэмптоне (штат Вирджиния). В 1962 г. космический отдел был переведен в Хьюстон (штат Техас), став частью Центра пилотируемых полетов (ныне - Центр космических исследований имени Линдона Джонсона).
Был запасным пилотом Алана Шепарда-мл. и Вирджила Гриссома, которые в 1961 г. совершили первые суборбитальные полеты - 5 мая на корабле Mercury-3 и 21 июля на Mercury-4 соответственно.
20 февраля 1962 г. первым из американских астронавтов совершил орбитальный полет, стал третьим человеком, побывавшим в космосе (после Юрия Гагарина и Германа Титова). Полет был осуществлен на корабле Mercury-6. Гленн трижды облетел Землю, провел в космосе 4 ч 55 мин. 23 сек.
До января 1964 г. числился астронавтом НАСА, работая в Центре пилотируемых полетов. В рамках программы Apollo ("Аполлон") участвовал в разработке лунного корабля.
В октябре 1964 г. Гленну было присвоено звание полковника морской пехоты США, а в январе 1965 г. он вышел в отставку.
В 1965-1974 гг. работал в различных коммерческих компаниях.
В ноябре 1974 г. избран в Сенат Конгресса США (от штата Огайо и Демократической партии), занимал пост сенатора до января 1999 г. (трижды переизбирался - в 1980, 1986 и 1992 гг.). Входил в состав нескольких комитетов: по делам вооруженных сил, по разведке, по делам престарелых и др.
Дважды, в 1984 и 1988 гг., выдвигался от Демократической партии на пост вице-президента и президента США соответственно, однако проиграл праймериз и в выборах не участвовал.
В 1997 г. Джон Гленн предложил НАСА свою кандидатуру для проведения на орбите медицинских (геронтологических) экспериментов. Для участия в космическом полете сенатору требовалось получить разрешение президента США. Гленн получил его от Билла Клинтона.
Выполнил свой второй полет 29 октября - 7 ноября 1998 г. (8 сут. 21 ч 44 мин.) в качестве специалиста по полезной нагрузке экипажа шаттла Discovery ("Дискавери"). На момент старта ему исполнилось 77 лет 3 месяца 11 дней. Таким образом, Джон Гленн стал самым пожилым человеком, побывавшем в космосе. Этот мировой рекорд не побит до сих пор. Кроме того, Гленн - второй сенатор-астронавт после Джейка Гарна, который совершил полет в 1985 г. на Discovery.
В общей сложности за два полета Джон Гленн провел в космосе 9 сут. 2 ч 40 мин. 18 сек.
В 2011 г. он перенес операцию по протезированию коленного сустава, в 2014 г. - по замене сердечного клапана. В декабре 2016 г. из-за ухудшения состояния здоровья был помещен в отделение для лечения онкологических заболеваний медицинского центра при Университете штата Огайо.
Скончался 8 декабря 2016 г. в возрасте 95 лет.

Награжден Золотой медалью Конгресса США (2009), Президентской медалью свободы (2012), шестью крестами "За выдающиеся заслуги", медалями "За воздушные операции", "За службу по защите нации", "За участие в военных действиях в Азии и на Тихом океане", "За участие в военных действиях ВС США, 1941-1946", "За победу во Второй мировой войне", "За службу в Китае", "За службу в Корее", Космической медалью почета Конгресса США. Отмечен медалями НАСА "За выдающиеся заслуги" и "За космический полет".

В 2006 г. стал лауреатом премии "Патриот Америки", присуждаемой фондом Национального университета обороны США.

Был женат на Анне Маргарет Кастор (Anna Margaret Castor). В браке родились двое детей: сын Джон Дэвид (John David, род. 1945 г.) и дочь Карелии Энн (Carolyn Ann, род. 1947 г.).