Родился 30 января 1900 г. в гор. Лохвица (Полтавская губерния Российской империи, ныне - Полтавская область Украины) в семье банковского служащего Цале-Йосефа Симоновича и Розалии Исааковны Дунаевских.
К шести годам Исаак Дунаевский знал музыкальную грамоту, играл на пианино. В возрасте восьми лет брал уроки скрипки. В 1910 г. семья Дунаевских переехала в Харьков. С десяти лет Исаак Дунаевский учился в частной музыкальной школе.
В 1919 г. окончил Харьковскую консерваторию (ныне - Харьковский национальный университет искусств имени И. П. Котляревского) по классу скрипки. Во время учебы начал сочинять романсы, фортепьянные пьесы, квартеты. После окончания консерватории работал скрипачом в оркестре, концертмейстером.
В 1920 г. был принят на работу в Харьковский русский драматический театр, где заведовал музыкальной частью. Как театральный композитор дебютировал в том же году, написав музыку к спектаклю "Женитьба Фигаро" по пьесе Пьера-Огюстена де Бомарше. Как дирижер впервые выступил в 1921 г., поставив совместно с руководителем театра Николаем Синельниковым спектакль "Перикола" по опере-буфф Жака Оффенбаха.
В 1924 г. Исаак Дунаевский переехал в Москву. Работал музыкальным руководителем эстрадного театра "Эрмитаж" (1924-1926), затем - Московского театра сатиры (1926-1929), для которого написал свои первые оперетты "Женихи" (1927, по пьесе Николая Адуева и Сергея Антимонова) и "Ножи" (1928, по рассказу Валентина Катаева).
В 1929 г. композитор был приглашен в качестве музыкального руководителя и главного дирижера в открывшийся в Ленинграде эстрадно-музыкальный театр "Мюзик-холл". Работал в нем до 1941 г., создал в сотрудничестве с Леонидом Утесовым несколько эстрадных программ.
В 1930-х гг. начал писать музыку к кинофильмам. Принимал участие в создании первой советской музыкальной кинокомедии "Веселые ребята" (1934, режиссер Григорий Александров), написанные для нее песни принесли композитору широкую известность. Работал с Александровым над фильмами "Цирк" (1936) и "Волга-Волга" (1938), за которые был удостоен в 1941 г. Сталинской премии. Затем написал музыку к картинам Александрова "Светлый путь" (1940) и "Весна" (1947). Также Исаак Дунаевский сотрудничал с режиссером Семеном Тимошенко, был автором музыки к его фильмам "Три товарища" (1935) и "Вратарь" (1936).
В 1937-1941 гг. являлся председателем Ленинградского отделения Союза композиторов СССР.
В 1937 г. Исаак Дунаевский создал и возглавил в качестве художественного руководителя Ансамбль песни и пляски Ленинградского Дворца пионеров (ныне - Ансамбль песни и танца им. И. О. Дунаевского Санкт-Петербургского городского Дворца творчества юных). Одновременно, с 1938 г. по 1948 г., руководил Ансамблем песни и пляски Центрального дома культуры железнодорожников в Москве.
В 1938 г. был избран депутатом Верховного совета РСФСР.
В годы Великой Отечественной войны Исаак Дунаевский во главе Ансамбля песни и пляски железнодорожников ездил по стране с концертными программами, выступал в воинских частях, госпиталях, на оборонных заводах. Создал более 70 музыкальных произведений на военную тему, в том числе в 1942 г. песню "Моя Москва" на стихи Марка Лисянского и Сергея Аграняна (другое название "Дорогая моя столица", с 1995 г. - официальный гимн Москвы).
С 1943 г. Исаак Дунаевский проживал в Москве.
В послевоенные годы написал музыку к оперетте "Вольный ветер" (постановка Иосифа Туманова), премьера которой состоялась 29 августа 1947 г. в Московском театре оперетты. Позднее, в 1961 г., оперетта была экранизирована режиссером Леонидом Траубергом.
За участие в 1949 г. в создании фильма "Кубанские казаки" Ивана Пырьева (премьера состоялась в феврале 1950 г.) Исаак Дунаевский во второй раз был награжден Сталинской премией (1951). Песня из фильма "Каким ты был, таким ты и остался" получила широкую популярность.
В 1950 г. в документально-художественном фильме "Мы за мир!" прозвучала песня композитора "Летите, голуби!" на стихи Михаила Матусовского.
Последней работой Дунаевского стала оперетта "Белая акация", завершить свое произведение он не успел, по его наброскам музыку закончил композитор Кирилл Молчанов. Ее первая постановка с участием Татьяны Шмыги и Михаила Качалова состоялась в 1959 г. в Московском театре оперетты.
В общей сложности Исаак Дунаевский создал 12 оперетт и написал музыку к 28 фильмам, также писал музыку к драматическим спектаклям, водевилям, балетам, пьесы для фортепиано, квартеты, романсы. Он был автором музыки многих популярных советских песен 1930-1950-х гг. Создал жанр песни-марша: "Марш энтузиастов" (фильм "Светлый путь"), "Песня о веселом ветре" (фильм "Дети капитана Гранта"), "Спортивный марш", "Марш трактористов", "Весенний марш" и др. Известны его патриотические "Песня о Родине" (или "Широка страна моя родная" на стихи Василия Лебедева-Кумача), "Звезды милой Родины", "Песня о Каховке" и др. Популярны его лирические композиции "Моя любовь", "Цветет калина", "Вечер вальса", "Школьный вальс" и др.
Исаак Дунаевский скончался 25 июля 1955 г. в Москве на 56-м году жизни от сердечного приступа. Похоронен на столичном Новодевичьем кладбище.
Заслуженный деятель искусств РСФСР (1936). Народный артист РСФСР (1950).
Был награжден орденами Трудового Красного Знамени (1936), "Знак Почета" (1942), Красной Звезды (1945).
Был женат на Зинаиде Судейкиной (1902-1979). Сын - Евгений (1932-2000, художник). В 1945 г. у композитора родился сын Максим. Его матерью была балерина Зоя Пашкова (1922-1991). Ныне Максим Дунаевский - известный эстрадный композитор, народный артист РФ.