Родился 4 октября 1965 г. в Новороссийске (Краснодарский край). Его отец был инженером, мать - архивистом.
В 1982 г. Евгений Касперский окончил математическую школу-интернат №18 им. Колмогорова при Московском государственном университете (МГУ) им. М.В. Ломоносова. В 1991 г. стал выпускником факультета криптографии, связи и информатики (4-й технический факультет) при Высшей школе КГБ (ныне - Академия ФСБ России), специальность - "инженер-математик".
С 1987 г. работал в научно-исследовательских институтах при Минобороны СССР, с 1989 г. стал изучать компьютерные вирусы.
В 1990 г. занялся разработкой антивирусного программного обеспечения при научно-техническом центре "КАМИ" в Москве. С 1994 г. это компьютерное приложение получило название AVP ("AntiViral Toolkit Pro", англ. "профессиональный антивирусный инструментарий"). К 1997 г. программа начала успешно выходить на международный рынок, компания заключила договоры о ее поставках с рядом иностранных фирм. В том же году Касперский ушел из "КАМИ" и основал собственную фирму - "Лаборатория Касперского", продолжившую выпускать антивирус. В 2000 г. AVP был переименован в "Антивирус Касперского". Впоследствии "Лаборатория" занялась комплексом программ для информационной безопасности, в настоящее время является одной из крупнейших мировых компаний в данной области.
С 2007 г. является генеральным директором "Лаборатории Касперского", бессменный руководитель отдела антивирусных исследований компании. Владеет 82,7% акций компании.
В 2015 г. журнал Forbes впервые включил Евгения Касперского в свой список миллиардеров мира, поместив его на 1741-е место с состоянием в 1 млрд долларов США. В 2020 г. занимает 1613-е место в мире и 74-е в России с 1,3 млрд долларов.
За крупные достижения в сфере современных систем защиты компьютерной информации в 2009 г. награжден Государственной премией РФ в области науки и технологий. Лауреат многочисленных премий и наград в компьютерной сфере.
Автор пяти книг, из них только одна "Компьютерные вирусы в MS-DOS" касается его профессиональных интересов, остальные посвящены путешествиям.
Женат, пятеро детей.
Увлекается путешествиями и альпинизмом, болельщик команды "Феррари" в автогонках в классе "Формула-1".