Родилась 11 июня 1953 г. в г. Сталинграде (ныне Волгоград). Ее отец - Валентин Митрофанов (1929-1981), был высокопоставленным сотрудником Госплана СССР.
В 1975 г. окончила факультет международных экономических отношений Московского государственного института международных отношений МИД СССР (ныне МГИМО МИД России) по специальности "экономист-международник".
Кандидат экономических наук.
С 1975 по 1990 г. была аспирантом, затем научным сотрудником в Государственном проектно-изыскательском и научно-исследовательском институте морского транспорта "Союзморниипроект".
В 1990-1993 гг. - генеральный директор юридической фирмы "Эколекс" (Москва).
В 1993-1995 гг. - депутат Государственной думы РФ I созыва. Была избрана 12 декабря 1993 г. по федеральному списку избирательного объединения "Либерально-демократическая партия России". Входила в состав комитета Госдумы по бюджету, налогам, банкам и финансам. Являлась членом фракции ЛДПР. Депутатские полномочия были прекращены досрочно 11 мая 1995 г. в связи с переходом на госслужбу.
С 7 апреля 1995 г. по 14 февраля 2001 г. - аудитор Счетной палаты РФ, курировала вопросы контроля за государственным долгом и банковской системой.
С 2001 г. - на дипломатической службе. С января 2001 г. по май 2003 г. - заместитель генерального директора ЮНЕСКО Коитиры Мацууры по вопросам образования, науки и культуры (Париж, Франция).
С 21 мая 2003 г. - первый заместитель министра иностранных дел РФ Игоря Иванова, с марта 2004 г. - Сергея Лаврова. Курировала вопросы, касающиеся защиты прав соотечественников за рубежом, культурного сотрудничества, деятельности Росзарубежцентра. Занимала пост до 13 августа 2004 г.
С августа 2004 г. по сентябрь 2008 г. - руководитель Российского центра международного научного и культурного сотрудничества (Росзарубежцентр) при МИД России. Освобождена от должности в связи с упразднением центра, функции которого были переданы Федеральному агентству по делам Содружества Независимых Государств, соотечественников, проживающих за рубежом, и по международному гуманитарному сотрудничеству (Россотрудничество).
С 28 января 2009 г. по 19 сентября 2016 г. - постоянный представитель РФ при ЮНЕСКО в Париже. Сменила на этом посту Владимира Каламанова. 23 ноября 2009 г. была избрана председателем исполнительного совета ЮНЕСКО на период 2010-2011 гг. С июня 2011 г. по июль 2012 г. - председатель комитета Всемирного наследия ЮНЕСКО.
С 25 октября 2016 г. по 19 декабря 2017 г. - посол по особым поручениям МИД РФ. Курировала вопросы, связанные с поддержкой изучения русского языка за рубежом, мировым культурным наследием, взаимоотношениями РФ с Латинской Америкой.
С 19 декабря 2017 г. по 10 июня 2020 г. - руководитель Федерального агентства по делам СНГ, соотечественников, проживающих за рубежом, и по международному гуманитарному сотрудничеству (Россотрудничество). Сменила на посту главы агентства Любовь Глебову, которая ранее, в сентябре 2017 г., была наделена полномочиями члена Совета Федерации РФ от Удмуртской Республики.
С 11 июня 2020 г. по 15 января 2021 г. Элеонора Митрофанова вновь занимала пост посла по особым поручениям МИД России.
С 15 января 2021 г. - чрезвычайный и полномочный посол РФ в Болгарии (вручила верительные грамоты 16 марта 2021 г.).
Действительный государственный советник РФ II класса (2019).
Имеет дипломатический ранг чрезвычайного и полномочного посла (2010).
Награждена орденами Дружбы (2003), Почета (2013), Александра Невского (2023), медалью ордена "За заслуги перед Отечеством" II степени (2008), знаком отличия "За безупречную службу" ХХ лет (2018). Отмечена Почетной грамотой правительства РФ (2008).
Имеет награду Сербской православной церкви - орден Святой царицы Милицы (2018).
Автор ряда научных публикаций, посвященных проблемам международных транспортных связей.
Владеет английским, французским и испанским языками.
Брат – Алексей Митрофанов (род. 1962), российский политик, депутат Госдумы РФ I - VI созывов (1993-2016), член партий ЛДПР (1991-2007) и "Справедливая Россия" (2007-2012).