Родился 20 мая 1963 г. в Москве.
В 1985 г. окончил филологический факультет Московского государственного педагогического института им. В. И. Ленина (ныне Московский педагогический государственный университет) по специальности "учитель русского языка".
Кандидат политических наук. В 2001 г. защитил диссертацию на тему "Политологический анализ процесса становления федеративных отношений в России".
После окончания вуза работал диспетчером Московского городского бюро путешествий и экскурсий, затем, в 1987-1988 гг. - инженером в Центре содействия творческой инициативе "Сотрудничество".
С 1987 г. - участник неформального движения, член клуба "Перестройка", в 1988-1989 гг. - группы "Перестройка-88". Одновременно в 1988-1989 гг. вместе с Вячеславом Игруновым, Владимиром Прибыловским и др. занимался выпуском самиздатской газеты "Хронограф", был одним из ее авторов.
В это же время работал в научно-аналитическом центре кооператива "Перспектива" по изучению самиздата, оказанию содействия изданиям различных неформальных групп.
Вместе с Вячеславом Игруновым основал исследовательский центр "Московское общественное Бюро информационного обмена", на основе которого в 1990 г. был учрежден Институт гуманитарно-политических исследований (ИГПИ), который возглавил Игрунов. В 1990 г. Сергей Митрохин стал главным научным сотрудником, затем заместителем директора ИГПИ. В 1992 г. окончил Высшие социологические курсы, организованные Игруновым.
В 1993 г., накануне первых выборов в Госдуму, участвовал в создании избирательного блока "Явлинский - Болдырев - Лукин" ("Яблоко").
12 декабря 1993 г. был избран депутатом Государственной думы РФ I созыва, вошел в состав комитета по делам Содружества Независимых Государств и связям с соотечественниками, был членом фракции "Яблоко". Впоследствии, 17 декабря 1995 г. и 19 декабря 1999 г., избирался депутатом Госдумы II и III созывов от "Яблока", в 1995 - 2003 гг. занимал пост заместителя председателя думского комитета по вопросам местного самоуправления.
В 1995 г. вошел в состав бюро центрального совета объединения "Яблоко". В 2000 г. избран секретарем объединения по идеологии.
В 2004-2018 гг. - глава московского регионального отделения партии "Яблоко". 2 июля 2018 г. федеральное бюро партии приостановило полномочия Сергея Митрохина как председателя московского отделения. На этом посту его сменил Николай Рыбаков (с 2019 г. - председатель партии).
В июне 2004 г. Сергей Митрохин был избран председателем Комитета защиты москвичей, общественной организации, созданной для борьбы с нарушением жилищных прав горожан и незаконной застройкой столицы. Комитет был образован активистами партии "Яблоко" и представителями инициативных групп москвичей, при содействии уполномоченного по правам человека в РФ Владимира Лукина; исполнительным секретарем организации стал Алексей Навальный.
В 2004-2008 гг. - заместитель председателя Российской объединенной демократической партии "Яблоко" (до 2006 г. - Российская демократическая партия "Яблоко").
Депутат Московской городской думы IV созыва (2005-2009). Был избран 4 декабря 2005 г. по общему списку кандидатов "Яблока" и СПС. Возглавил фракцию "Яблоко – Объединенные демократы". Был членом комиссий Мосгордумы по безопасности, по городскому хозяйству и жилищной политике; по государственному строительству и местному самоуправлению; по организации работы думы; по перспективному развитию и градостроительству; по экологической политике; входил в состав бюджетно-финансовой комиссии.
В 2008-2015 гг. - председатель Российской объединенной демократической партии "Яблоко".
На XV съезде "Яблока" 21-22 июня 2008 г. избран новым председателем партии, сменил на этом посту Григория Явлинского, отказавшегося от участия в выборах в пользу Митрохина. 16 июня 2012 г. Сергей Митрохин был переизбран председателем Российской объединенной демократической партии "Яблоко".
В 2013 г. выдвигался кандидатом от "Яблока" на выборах мэра Москвы. По итогам голосования 8 сентября того же года получил 3,51% голосов избирателей, занял 4-е место после Сергея Собянина, Алексея Навального и Ивана Мельникова.
На съезде Российской объединенной демократической партии "Яблоко" 19 декабря 2015 г. были приняты изменения в устав, запрещающие занимать пост председателя партии одному лицу более двух сроков. В результате Сергей Митрохин не смог принять участие в выборах председателя. На посту главы "Яблока" его сменила депутат заксобрания Карелии Эмилия Слабунова ("за" - 91 голос).
22 июня 2018 г. делегаты конференции столичного отделения "Яблока" выдвинули Митрохина кандидатом на предстоящие в сентябре 2018 г. выборы мэры Москвы. Однако 25 июня бюро партии отменило это решение. В соответствии с уставом, кандидатов для участия в выборах глав субъектов РФ региональные отделения могут выдвигать только из числа лиц, предварительно согласованных бюро партии или исполкомом бюро. Для выдвижения на выборы мэра столицы исполком бюро партии согласовал лишь одну кандидатуру - главы муниципального округа "Гагаринский" Елены Русаковой, но она не набрала необходимого числа голосов делегатов конференции. Кандидатура Митрохина согласована с бюро партии не была.
Член федерального политического комитета "Яблока", руководитель Центра защиты прав граждан партии.
8 сентября 2019 г. был избран депутатом Московской городской думы VII созыва от партии "Яблоко" по избирательному округу №43 (р-ны Пресненский, Хамовники). На выборах получил 44,7% голосов.
Женат, супруга - Наталья. Имеет дочь (род. 2002).