Родилась 9 декабря 1954 г. в г. Буе Костромской области.
Девичья фамилия – Дмитриева.
В 1977 г. окончила истории и права Ярославского государственного университета, получив квалификацию юриста (ЯГУ; ныне Ярославский государственный университет им. П. Г. Демидова). В 2005 г. получила диплом Российской академии государственной службы при президенте РФ (ныне Российская академия народного хозяйства и государственной службы при президенте РФ).
Доктор юридических наук. В 1983 г. в ЯГУ защитила кандидатскую диссертацию на тему "Природа надзорного производства в уголовном процессе (по материалам Ярославского областного суда)". В 1993 г. в Институте государства и права Российской академии наук защитила докторскую диссертацию на тему "Уголовный процесс: концепция самоограничения государства". Профессор.
После окончания вуза работала лаборантом на кафедре теории и права Ярославского госуниверситета. В 1977-1984 гг. была консультантом, в 1984-1985 гг. - старшим консультантом Ярославского областного суда.
Член КПСС до 1991 г.
В 1985 г. перешла в Ярославский государственный педагогический институт им. К. Д. Ушинского ассистентом. Затем работала старшим научным сотрудником института. В 1987-1990 гг. заведовала кафедрой отечественной истории.
В 1992-1995 гг. - доцент, профессор кафедры уголовного права и процесса Ярославского государственного университета им. П. Г. Демидова.
С 1993 по 1996 г. - депутат Совета Федерации РФ I созыва. 12 декабря 1993 г. была избрана по Ярославскому двухмандатному избирательному округу №76 (выдвинута избирательным блоком "Выбор России"). С 15 января 1994 г. - заместитель председателя комитета СФ по конституционному законодательству и судебно-правовым вопросам. Полномочия сенатора были прекращены 15 января 1996 г. в связи с избранием в Госдуму РФ.
В 1994 г. - председатель Ярославской региональной общественной организации "Равновесие".
В 1995 г. возглавила ярославское региональное отделение объединения "Яблоко" (с 2001 г. - партия "Яблоко").
С декабря 1995 г. по декабрь 2004 г. - депутат Государственной думы РФ II и III созывов. С 1996 по 2001 г. входила во фракцию "Яблоко", с 2001 по 2004 г. - "Союз правых сил" (СПС; партия существовала до 2008 г.).
17 декабря 1995 г. была избрана в Государственную думу РФ II созыва по Кировскому избирательному округу №189 (Ярославская область). Баллотировалась от "Яблока", на выборах получила 28,82% голосов (второе место - у кандидата от "Демвыбора России" Владимира Варухина, 11,24%). В Думе Елена Мизулина вошла во фракцию "Яблоко". В 1996-1999 гг. была заместителем председателя комитета палаты по законодательству и судебно-правовой реформе, заместителем главы подкомитета по вопросам государственного строительства и конституционных прав граждан. В 1998-1999 гг. - заместитель председателя специальной комиссии по оценке соблюдения правил и фактической обоснованности обвинения, выдвинутого против президента РФ (в 1999 г. Госдума предприняла попытку импичмента Борису Ельцину по обвинению в развале СССР, роспуске Съезда народных депутатов и Верховного совета, развязывании войны в Чечне и др.).
В 1999 г. возглавила координационный совет ярославского регионального отделения СПС.
В декабре 1999 г. баллотировалась в Госдуму III созыва от объединения "Яблоко" в составе федерального списка кандидатов (возглавляла региональную группу №4, "Северный") и по Кировскому одномандатному округу №189 (Ярославская область). По итогам выборов 19 декабря 1999 г. в округе заняла 4-е место (из 17 кандидатов), набрав 8,99% голосов. Победу одержал Сергей Загидуллин (23,56%), выдвинутый группой избирателей. Елена Мизулина прошла в Госдуму по федеральному списку "Яблока", который набрал 5,93% голосов.
В Госдуме III созыва была заместителем председателя комитета по законодательству, входила в комиссии по этике, по вопросам профилактики безнадзорности, беспризорности и наркомании среди несовершеннолетних и молодежи. В 2000 г. стала соавтором законопроекта о создании в России ювенальных судов. В 2003 г. предлагала сократить бытовые и пенсионные привилегии бывших членов Совета Федерации и депутатов Госдумы.
В июле 2000 г. стала председателем т. н. Ярославского союза демократических сил, куда вошли региональные отделения "Яблока" и СПС.
В декабре 2000 г. выступила с предложением о самороспуске ярославского отделения "Яблока" с тем, чтобы создать объединенную с СПС демократическую партию. После отказа руководства центральных органов партии поддержать эту инициативу 26 декабря 2000 г. сложила полномочия председателя ярославского отделения "Яблока". При этом осталась председателем координационного совета регионального отделения СПС.
27 февраля 2001 г. сообщила о своем фактическом выходе из "Яблока", заявив, что не намерена подтверждать свое членство в объединении, хотя пока и не планирует выходить из парламентской фракции (устав "Яблока" содержал норму о ежегодном подтверждении членства). Однако уже в июне 2001 г. стала членом фракции СПС в Госдуме.
С 2004 по 2007 г. была заместителем начальника правового управления аппарата Госдумы. Одновременно являлась постоянным представителем Государственной думы в Конституционном суде (КС) РФ.
В период с сентября по декабрь 2007 г. была советником председателя Совета Федерации РФ Сергея Миронова.
В 2007 г. вошла в состав президиума центрального совета партии "Справедливая Россия: Родина/Пенсионеры/Жизнь" (с 2009 г. - "Справедливая Россия"). Оставалась членом партии до 2017 г. (заявила о выходе из нее 23 января 2017 г.).
В 2007-2015 гг. - депутат Государственной думы РФ V и VI созывов, член фракции "Справедливая Россия".
2 декабря 2007 г. была избрана в Госдуму V созыва. Баллотировалась по федеральному списку "Справедливой России" (возглавляла региональную группу №60, Омская область). В январе 2008 г. возглавила парламентский комитет по вопросам семьи, женщин и детей. Выступала за ограничение рекламы абортов в печатных СМИ, табака, за ужесточение наказания за изготовление и оборот детской порнографии и др.
4 декабря 2007 г. стала депутатом Госдумы VI созыва от партии "Справедливая Россия". С 2011 г. возглавляла комитет ГД по вопросам семьи, женщин и детей. Входила в межфракционную группу по защите христианских ценностей. Была автором законопроектов о запрете усыновления российских детей гражданами США (т. н. закон Димы Яковлева), о запрете нецензурной лексики, о борьбе с пропагандой гомосексуализма, о декриминализации побоев.
Депутатские полномочия Елены Мизулиной были прекращены досрочно 13 октября 2015 г. в связи с ее переходом в верхнюю палату парламента.
В 2015-2023 гг. - член Совета Федерации РФ от Омской области. Была наделена полномочиями сенатора - представителя от исполнительного органа власти региона 23 сентября 2015 г. указом губернатора Омской области Виктора Назарова (полномочия подтверждены 14 сентября 2018 г.). 17 сентября 2018 г. вновь стала сенатором от администрации Омской области, соответствующий указ подписал избранный губернатор области Александр Бурков. С октября 2015 г. по ноябрь 2020 г. - заместитель председателя комитета Совфеда по конституционному законодательству и государственному строительству. В сентябре 2023 г. сенатором от исполнительной власти Омской области стал Иван Евстифеев.
Елена Мизулина известна как сторонник ограничения прав женщин на аборт, запрета суррогатного материнства и использования беби-боксов, ужесточения ответственности за преступления сексуального характера против несовершеннолетних, об ограничении продажи алкогольных энергетиков, запрета на браки и усыновление детей лицам одного пола и тем, кто ранее сменил пол, и др. Выступает за усиление роли церкви в государстве и семье. В частности, в 2013 г. совместно с межфракционной группой Госдумы по защите христианских ценностей предлагала включить в Конституцию РФ статью об особой роли православия как "основы национальной и культурной самобытности России".
Заслуженный юрист РФ (2003).
Награждена орденами Почета (2012), Дружбы (2018).
Лауреат Национальной премии общественного признания достижения женщин "Олимпия" (2001), имеет медаль Всемирного конгресса семей (2010).
Автор книг "Уголовный процесс: концепция самоограничения государства" (1991), учебного пособия "Правовые основы профессиональной ориентации школьников" (1988), монографии "Торговля людьми и рабство в России: международно-правовой аспект" (2006) и др.
Владеет немецким языком.
Замужем, имеет двоих детей. Дочь - Екатерина Мизулина (род. 1984) - возглавляет Лигу безопасного интернета.