Родился 30 августа 1863 г. в селе Фуникова Гора в Покровском уезде Владимирской губернии (ныне Киржачский район Владимирской области) в имении родителей.
Формального образования Сергей Прокудин-Горский не получал. В 1880-е гг. посещал курсы и слушал лекции в Александровском лицее (Санкт-Петербург), Санкт-Петербургском университете, Императорской военно-медицинской академии и Императорской академии художеств.
В 1890 г. женился на Анне Лавровой, дочери промышленника Александра Лаврова, и был назначен тестем на должность директора правления на его предприятиях в Гатчине. Примерно в этот же период Сергей Прокудин-Горский увлекся фотографией и техническими исследованиями в этой области. В 1898 г. был принят в члены фотографического отдела Императорского русского технического общества (ИРТО). В 1901 г. открыл собственную "фотоцинкографическую и фототехническую мастерскую".
В 1902 г. Сергей Прокудин-Горский побывал в Германии, где познакомился с технологией "трехцветной естественной фотографии" немецкого ученого Адольфа Мите. Она заключалась в съемках по очереди через светофильтры синего, зеленого и красного цветов. Полученные три негатива-слайда потом можно было демонстрировать через проектор. Вернувшись в Россию, Прокудин-Горский усовершенствовал эту изохроматическую технологию, в частности, разработал новые методы сенсибилизации фотоэмульсии, повышавшие чувствительность фотопластин к видимому спектру. Это позволило снимать цветные кадры с минимальной выдержкой. Эта технология была сложнее "автохрома", запатентованного братьями Луи Жаном и Огюстом Луи Люмьер, позволявшего делать цветные кадры в одну экспозицию. Вместе с тем, она обеспечивала намного более качественную передачу цвета и деталей и, что потом оказалось особенно важно, полученные негативы оказывались долговечнее.
В 1904 г. Прокудин-Горский совершил поездку по окрестностям Петербурга и Великому княжеству Финляндскому, сделав первую серию цветных фотоснимков. В 1907 г. он впервые побывал в Туркестане. В 1908 г. посетил писателя Льва Толстого в Ясной Поляне (под Тулой). В мае 1909 г. Сергей Прокудин-Горский получил аудиенцию у императора Николая II, который одобрил план фотографа запечатлеть Россию в цветных фотоснимках. Хотя сами путешествия Прокудин-Горский оплачивал за свой счет, Николай II распорядился оказывать фотографу помощь "на местах", выделять ему транспорт и провожающих.
В 1909-1916 гг. Сергей Прокудин-Горский объездил значительную часть Европейской территории России, Карелию, Белоруссию, Литву, фотографировал на Урале, в Средней Азии, в Крыму и на Кавказе. Он запечатлел современные виды городов, храмов, монастырей, промышленных предприятий, инженерные сооружения, бытовые сцены, облик местных жителей.
В годы Первой мировой войны занимался вопросами аэрофотосъемки, также привлекался к военной цензуре заграничных кинолент.
После прихода большевиков к власти Сергей Прокудин-Горский продолжал работать в России, демонстрировал свои фотоснимки, входил в организационный комитет Высшего института фотографии и фототехники. В августе 1918 г. по заданию Наркомата просвещения он отправился в командировку в Норвегию для закупки оборудования для школ, но решил на родину не возвращаться. В 1919 г. Сергей Прокудин-Горский перебрался в Англию, а в 1922 г. поселился в Ницце (Франция), где открыл фотомастерскую. В 1931 г. ему удалось переправить из России половину своей фотографической коллекции. Последние годы жизни провел в Париже.
Скончался 27 сентября 1944 г. в Париже на 82-м году жизни, вскоре после освобождения французской столицы от гитлеровской оккупации. Похоронен на кладбище Сент-Женевьев-де-Буа.
В 1948 г. фотоархив Прокудина-Горского (1 902 цветных негатива и 710 черно-белых фотографий) был приобретен Библиотекой Конгресса США. Широкий интерес к работам фотографа возник в начале 2000-х гг., когда компьютерные технологии позволили сканировать негативы в высоком разрешении и объединить их в цветной цифровой снимок. Технологии, разработанные Прокудиным-Горским, позволили воссоздать его фотографии в высоком качестве. Всего к настоящему времени известны 2 708 снимков, сделанных Прокудиным-Горским в России и за рубежом. При этом неизвестной остается судьба примерно половины архива фотографа, которую не удалось переправить во Францию. Предположительно, цветные слайды могли быть спрятаны на даче Прокудина-Горского под Лугой (Ленинградская область) и погибли в годы Великой Отечественной войны.
О творчестве Сергея Прокудина-Горского снят документальный фильм "Россия в цвете" (2010).