Родился 7 июля 1922 г. в Москве в семье почтового служащего.
Окончил десять классов средней школы. В 1940 г. добровольцем вступил в Рабоче-крестьянскую Красную армию (РККА). В 1943 г. окончил Тамбовскую военную авиационную школу пилотов и был направлен на фронт.
В годы Великой Отечественной войны 1941-1945 гг. служил летчиком, командовал звеном в составе 672-го штурмового авиационного полка 306-й штурмовой авиационной Нижнеднепровской дивизии 10-го штурмового авиационного корпуса 17-й воздушной армии 3-го Украинского фронта. На штурмовике Ил-2 произвел 140 боевых и 50 разведывательных вылетов, включая полеты для фотографирования защищенных объектов противника. В 19 воздушных боях сбил три самолета противника. Воевал в небе Украины, Молдавии, Румынии, Болгарии, Югославии, участвовал в освобождении Венгрии и Австрии.
Указом Президиума Верховного Совета СССР от 29 июня 1945 г. лейтенанту Владимиру Серегину было присвоено звание Героя Советского Союза с вручением ордена Ленина и медали "Золотая Звезда" ("за успешное совершение боевых вылетов, образцовое выполнение заданий и проявленные при этом отвагу и героизм").
После войны продолжил службу в Военно-воздушных силах (ВВС) СССР.
В 1953 г. окончил инженерный факультет Военно-воздушной инженерной академии им. Н. Е. Жуковского в Москве (ныне Военно-воздушная академия им. профессора Н. Е. Жуковского и Ю. А. Гагарина в г. Воронеже). Затем по собственному желанию был назначен в 4-е научно-испытательное управление Государственного научно-испытательного института ВВС (ныне Государственный центр подготовки авиационного персонала и войсковых испытаний Минобороны РФ им. В. П. Чкалова). Летал на истребителях МиГ-15 и МиГ-17.
В 1958 г. получил квалификацию летчика-испытателя второго класса.
С 1962 г. командовал Смешанной авиационной эскадрильей Центра подготовки космонавтов ВВС (ныне Научно-исследовательский испытательный центр подготовки космонавтов им. Ю. А. Гагарина, Звездный городок, Московская обл.), на самолетах которой отрабатывались элементы подготовки космонавтов для полетов на космических кораблях "Восток", "Восход" и "Союз".
В 1967 г. на базе эскадрильи был сформирован 70-й Отдельный испытательный тренировочный авиационный полк особого назначения (аэродром Чкаловский на окраине г. Щёлково, Московская обл.), командиром которого был назначен Владимир Серегин. В том же году ему была присвоена квалификация "летчик-испытатель первого класса".
Погиб 27 марта 1968 г. на 46-м году жизни в авиакатастрофе близ деревни Новоселово Киржачского района Владимирской области. Владимир Серегин в качестве инструктора выполнял тренировочный полет на истребителе МиГ-15УТИ совместно с летчиком-космонавтом Юрием Гагариным (Гагарин сидел спереди, Сергин - сзади). Самолет вошел в штопор и врезался в землю, что привело к гибели экипажа. Точная причина авиакатастрофы не установлена. 30 марта 1968 г. урны с прахом Гагарина и Серегина были захоронены с воинскими почестями у Кремлевской стены на Красной площади Москвы. В 1975 г. на месте гибели летчиков был открыт мемориал.
Сергей Серегин имел звание инженер-полковника.
Был награжден орденом Ленина (1945), двумя орденами Красного Знамени (оба в 1944), орденами Отечественной войны I и II степени (оба в 1945), орденом Отечественной войны II степени (1945), четырьмя орденами Красной Звезды (1944, 1955, 1957, 1968), медалями.