Родился 24 января 1873 г. (по старому стилю 12 января 1873 г.) в Москве.
В 1895 г. окончил историко-филологический факультет Императорского Московского университета (ныне Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова, МГУ). Ученик основоположника московской лингвистической школы Филиппа Фортунатова. Также своими учителями Ушаков считал филолога Федора Корша и историка Василия Ключевского.
Доктор лингвистических наук (русский язык, 1936), профессор (1921). В 1939 г. был избран членом-корреспондентом Академии наук СССР (ныне Российская академия наук, РАН) по Отделению общественных наук (филология).
В период с 1896 по 1913 г. работал школьным учителем.
В 1901 г. Дмитрий Ушаков получил степень магистра русского языка и стал параллельно преподавать в Московском университете. Сначала был приват-доцентом кафедры русского языка, затем - профессором кафедры русского языка и русской литературы историко-филологического факультета.
В 1903-1931 гг. работал в Московской диалектологической комиссии при РАН, затем при АН СССР. Сначала был товарищем (заместителем) председателя комиссии Федора Корша, а после его смерти в 1915 г. возглавлял комиссию вплоть до ее ликвидации.
Кроме того, преподавал на Высших женских педагогических курсах (1907-1918), Московских высших женских курсах (1909-1919), Высших женских курсах, учрежденных Варварой Полторацкой (1910-1919), а также в Высшей военно-педагогической школе (1919-1922), Высшем литературно-художественном институте им. В. Я. Брюсова (1924-1925) и др. московских вузах.
Был одним из авторов реформы русской орфографии (1917-1918), постоянным консультантом по вопросам орфоэпии Всероссийского театрального общества и Радиокомитета.
В 1920-1929 гг. работал в Институте языка и литературы Российской ассоциации научно-исследовательских институтов общественных наук (РАНИОН), где с 1923 по 1927 г. возглавлял лингвистическую секцию. При этом продолжал преподавать в МГУ. В 1921-1925 гг. являлся профессором кафедры славяно-русской филологии факультета общественных наук, а также действительным членом Научно-исследовательского института языковедения и истории литературы (1922-1925), действовавшего при факультете. В 1925-1930 гг. - профессор кафедры русского языка этнологического факультета университета.
В 1934-1941 гг. заведовал кафедрой русского языка в Московском институте философии, литературы и истории (с 1938 г. - МИФЛИ им. Н. Г. Чернышевского). МИФЛИ, созданный в 1931 г. на основе ряда факультетов МГУ, воссоединился с университетом в конце 1941 г.
С сентября 1939 г. Дмитрий Ушаков также работал в Институте языка и письменности АН СССР (существовал в 1924-1944 гг.), где заведовал славянским сектором.
Являлся редактором "Орфографического словаря русского языка" (1934) и четырехтомника "Толковый словарь русского языка" (1935-1940), который стал первым советским нормативным словарем, достаточно полно отразившим лексику литературного русского языка своего времени. В составлении т. н. словаря Ушакова принимали участие известные советские ученые: лингвисты Виктор Виноградов, Григорий Винокур, языковед Сергей Ожегов, филолог Борис Томашевский и др.
После начала Великой Отечественной войны, в октябре 1941 г., Дмитрий Ушаков с семьей был эвакуирован в Ташкент (Узбекская ССР, ныне Республика Узбекистан), где освоил узбекский язык и составил русско-узбекский разговорник. Находясь в эвакуации, заведовал кафедрой славяно-русского языкознания филологического факультета МГУ (1941-1942), продолжал руководить редакционным коллективом "Толкового словаря".
17 апреля 1942 г. скончался в Ташкенте на 70-м году жизни от воспаления легких, был похоронен на Русском (Боткинском) кладбище города.
Дмитрий Ушаков являлся специалистом по русской диалектологии и лексикологии, основоположником русской орфоэпии. Исследования ученого были посвящены также лексикографии, теоретической грамматике, педагогике, описательной фонетике, стилистике, истории русского языка и др. Среди его основных трудов: "Введение в языковедение" (1908), "Русское правописание" (1911), "Краткое введение в науку о языке" (1913), "Русская орфоэпия и ее задачи" (1928), "Русский литературный язык" (1929), "Орфографический словарь: для учащихся средней школы" (1934) и др.
Основатель научной школы лингвистов. Среди его учеников были Рубен Аванесов, Петр Богатырев, Григорий Винокур, Александр Реформатский, Абрам Шапиро, Роман Якобсон и др.
Кавалер орденов Российской империи Святого Станислава II и III степеней (1910, 1903), Святой Анны III степени (1906). Был награжден советским орденом "Знак Почета" (1940).
Являлся членом Общества любителей естествознания, антропологии и этнографии (1897), Педагогического общества при Московском университете (1898), Московского археологического общества (1912), Географического общества (1914), Общества любителей российской словесности при Московском университете (1920) и др.