Родился 4 марта 1934 г. в Москве.
Изучал биологию в Московском пушно-меховом институте в Балашихе (Московская область), а затем в Иркутском сельскохозяйственном институте. Во время учебы познакомился с Александром Менем, будущим протоиереем Русской православной церкви (РПЦ), богословом. Под влиянием Александра Меня в 1958 г. поступил в Московскую духовную семинарию, но спустя год был исключен из нее.
Служил псаломщиком в московских храмах.
В августе 1962 г. рукоположен в сан священника РПЦ, служил в Никольском храме г. Зарайска Московской области. Через год получил назначение в Казанский храм подмосковского г. Дмитрова.
В 1965 г. вместе со священником Николаем Эшлиманом обратился с открытым письмом к патриарху Алексию I о положении православной церкви в СССР и о нарушении органами государственной власти прав и свобод верующих. Копии письма были направлены священнослужителями председателю Президиума Верховного Совета СССР Николаю Подгорному, председателю Совета министров Алексею Косыгину и генеральному прокурору Роману Руденко, а также всем архиереям Московского патриархата.
13 мая 1966 г. руководство Московского патриархата лишило Глеба Якунина священного сана с формулировкой "до полного раскаяния". 23 мая Глеб Якунин и Николай Эшлиман обратились в Священный Синод с апелляцией, однако она осталась без удовлетворения.
В 1960-1970 гг. активно участвовал в правозащитном движении. В декабре 1976 г. стал соучредителем и председателем "Христианского комитета защиты прав верующих в СССР", который действовал при Московской Хельсинской группе (общественной правозащитной организации).
Был автором многочисленных материалов о подавлении религиозной свободы в Советском Союзе.
1 ноября 1979 г. был арестован, 28 августа 1980 г. приговорен Мосгорсудом по ч. 1 ст. 70 УК РСФСР за "антисоветскую агитацию и пропаганду". Пять лет провел в заключении - сначала в Лефортовской тюрьме, затем в лагере для политзаключенных "Пермь-37". Еще более двух лет - в ссылке в Якутии.
Был освобожден по амнистии в 1987 г., объявленной в связи с 70-летием Октябрьской революции (реабилитирован Постановлением Верховного Совета РФ 18 октября 1991 г.).
В 1987 г. восстановлен в священническом сане. Служил в Никольском храме с. Жигалово (Щелковский район Московской области) до 1992 г.
В начале 1990-х гг. был членом Российского христианско-демократического союза.
С октября 1990 г. являлся сопредседателем движения "Демократическая Россия" вместе со Львом Пономаревым, Василием Гуслянниковым и Виктором Курочкиным. С 1991 г. занимал пост сопредседателя Координационного совета, с 1992 г. - сопредседателя совета представителей движения "Демократическая Россия" .
В 1990-1993 гг. - народный депутат РСФСР. Член Верховного Совета (ВС) РСФСР, заместитель председателя Комитета ВС РСФСР по свободе совести. Участвовал в работе над законом "О свободе вероисповеданий", способствовал открытию храмов и монастырей. В 1991-1992 гг. входил в состав Комиссии ВС по расследованию причин и обстоятельств попытки государственного переворота в августе 1991 г. (ГКЧП).
В ноябре 1993 г. был лишен сана священника за "сознательное непослушание Церкви": за то, что не подчинился запрету Священного Синода на участие священнослужителей в выборах в органы государственной власти. Однако Глеб Якунин не признал решение Синода законным.
В июне-октябре 1993 г. движение "Демократическая Россия" приняло участие в создании избирательного объединения "Выбор России". В декабре 1993 г. Глеб Якунин был избран депутатом Государственной думы Федерального собрания РФ первого созыва по списку блока "Выбор России", до 1994 г. был членом фракции "Выбор России" (лидер - Егор Гайдар).
В 1994 г. часть участников движения "Демократическая Россия" во главе с Галиной Старовойтовой и Львом Пономаревым создали Федеральную партию "Демократическая Россия" (ФПДР). В 1995 г. Глеб Якунин был избран ее сопредседателем.
В 1995 г. стал одним из создателей Общественного комитета защиты свободы совести (по защите прав верующих).
Несмотря на лишение сана, Глеб Якунин продолжал носить рясу священника и иерейский крест, за что в 1997 г. был отлучен от церкви и предан анафеме.
С 2000 г. входил в так называемое "Движение за возрождение российского православия", переименованное впоследствии в Апостольскую православную церковь.
Член Московской Хельсинской группы, занимался правозащитной деятельностью. Был одним из авторов открытого письма о преследовании российских граждан по политическим мотивам (в защиту ученых Игоря Сутягина и Валентина Данилова, предпринимателей Михаила Ходорковского и Платона Лебедева, и др.).
18 ноября 2014 г. после поездки в США Глеб Якунин был госпитализирован и помещен в отделение интенсивной терапии Центральной клинической больницы в Москве. Скончался 25 декабря 2014 г.