Родился 14 июня 1968 г. в г. Нефтекамске в Башкирии.
В 1985 г. поступил в псковский филиал Ленинградского политехнического института (ныне в составе Псковского государственного университета), где обучался в течение года. В 1993 г. окончил Тюменский государственный университет по специальности "юрист", в 1997 г. там же получил второе высшее образование по специальности "финансы и кредит", получив квалификацию экономиста.
Кандидат экономических наук. В 2005 г. в Тюменском государственном нефтегазовом университете защитил диссертацию на тему "Программно-целевое управление территориальным развитием сложнопостроенного региона".
В 1986-1988 гг. проходил срочную службу в Вооруженных силах СССР.
В 1993 г. работал юрисконсультом в филиале Западно-Сибирского коммерческого банка (Запсибкомбанк) в г. Надыме Ямало-Ненецкого АО. В 1994-1995 гг. был и. о. директора, в 1995-1997 гг. - директором филиала Запсибкомбанка.
С мая 1997 г. по апрель 1998 г. - вице-президент - директор салехардского филиала, затем первый вице-президент Запсибкомбанка.
С 29 апреля 1998 г. занимал должность президента ОАО "Запсибкомбанк".
В декабре 2000 г. - январе 2001 г., в период кампании по выборам губернатора Тюменской области, был председателем инициативной группы по выдвижению Сергея Собянина на пост руководителя региона, также являлся его доверенным лицом.
В 2001 г., после избрания Сергея Собянина губернатором Тюменской области, Владимир Якушев перешел на работу в обладминистрацию. 13 июня 2001 г. он был назначен заместителем губернатора Тюменской области.
В марте 2005 г. - первый заместитель главы администрации Тюмени Степана Киричука.
В марте - апреле 2005 г. исполнял обязанности главы администрации Тюмени. 14 апреля 2005 г. был избран на пост главы города депутатами гордумы.
В 2005-2018 гг. - губернатор Тюменской области. Был наделен полномочиями губернатора 24 ноября 2005 г. депутатами Тюменской областной думы по представлению президента РФ Владимира Путина (бывший глава области Сергей Собянин был назначен руководителем администрации главы государства). В тот же день Владимир Якушев принес присягу, вступив в должность. 12 октября 2010 г. он вновь был утвержден на посту главы Тюменской области депутатами регионального парламента по представлению президента РФ Дмитрия Медведева. Вступил в должность 24 ноября 2010 г.
17 мая 2014 г. президент РФ Владимир Путин принял досрочную отставку Владимира Якушева с поста губернатора Тюменской области, назначив его временно исполняющим обязанности руководителя региона. 14 сентября 2014 г. Владимир Якушев победил на прямых выборах главы Тюменской области (баллотировался от партии "Единая Россия"), получив 86,56% голосов избирателей. Его ближайший соперник, депутат облдумы Михаил Селюков (ЛДПР), набрал 6,21%. 25 сентября того же года Владимир Якушев официально вступил в должность. Занимал пост губернатора до мая 2018 г.
С 18 мая 2018 г. по 9 ноября 2020 г. - министр строительства и жилищно-коммунального хозяйства РФ (сменил во главе ведомства Михаила Меня).
С 9 ноября 2020 г. по 24 сентября 2024 г. - полномочный представитель президента РФ в Уральском федеральном округе (сменил на посту Николая Цуканова).
С 16 ноября 2020 г. по 30 сентября 2024 г. был членом Совета безопасности РФ.
С 2012 г. входил в высший совет партии партии "Единая Россия", бюро совета.
С 15 июня 2024 г. по 14 декабря 2024 г. - врио секретаря генерального совета "Единой России" (был назначен председателем партии Дмитрием Медведевым; сменил Андрея Турчака, который возглавил Республику Алтай).
С 2024 г. - сенатор РФ - представитель от исполнительного органа власти Тюменской области. Был наделен полномочиями сенатора 25 сентября 2024 г. губернатором области Александром Моором (сменил в Совфеде Павла Тараканова). С 25 сентября 2024 г. - первый заместитель председателя Совета Федерации.
С 14 декабря 2024 г. - секретарь генерального совета "Единой России". Входит в состав президиума генсовета по должности. Член бюро высшего совета "Единой России".
Входил в состав Государственного совета РФ, в 2006, 2008 и 2014 гг. был членом его президиума.
Действительный государственный советник РФ I класса (2020).
Награжден орденами Александра Невского (2022), Почета (2008) и "За заслуги перед Отечеством" IV степени (2012). Имеет благодарность президента РФ (2009), благодарность правительства РФ (2025).
Почетный гражданин Тюменской области (2018).