Родилась 28 апреля 1926 г. в г. Монровилл (шт. Алабама, США) в семье юриста Амаса Колмана Ли (1880-1962) и домохозяйки Франсес Каннингем Финч Ли (1988-1951). В детстве другом Харпер Ли был Трумен Капоте, также ставший впоследствии известным американским писателем.
В 1944-1945 гг. училась в Хантингдонском колледже (г. Монтгомери, шт. Алабама). Затем в 1945-1949 гг. изучала юриспруденцию в Алабамском университете (г. Таскалуса, шт. Алабама), учебу не закончила.
В студенческие годы писала статьи для университетской газеты. В 1949 г. переехала в Нью-Йорк, где до конца 1950-х гг. работала в представительствах авиакомпаний Eastern Air Lines и British Overseas Airways Corporation. Свободное время посвящала литературному творчеству, написала несколько рассказов, в 1957 г. завершила работу над романом "Пойди, поставь сторожа" ("Go Set A Watchman"), который был опубликован только в 2015 г.
В 1959 г. написала роман "Убить пересмешника" ("To Kill a Mockingbird"). В книге отражены быт и порядки американского Юга времен Великой депрессии (1929-1939). Расовая дискриминация и бедность, охватившая США в это время, показаны через восприятие главного героя - девочки-подростка. Американские критики назвали роман "лучшим произведением столетия". По их оценке, книга стала "литературным манифестом антирасизма" и значимым вкладом в борьбу за гражданские права в США.
Роман был опубликован в США в 1960 г. и сразу стал бестселлером. В 1961 г. Ли получила за него Пулитцеровскую премию. В 1962 г. вышла одноименная экранизация, в которой главную роль сыграл известный американский актер Грегори Пек (реж. Роберт Маллиган). Картина была номинирована на премию "Оскар" в восьми категориях. В итоге фильм получил призы за лучшую мужскую роль, за лучший адаптированный сценарий и за лучшие декорации.
После издания романа "Убить пересмешника" Ли вела закрытый образ жизни, практически не давала интервью и не участвовала в общественной жизни, а также почти не писала. Исключением стали несколько коротких эссе, кроме того, Харпер Ли какое-то время работала над повестью "Долгое прощание" ("The Long Goodbye"), однако так и не закончила ее. В 1980-х писательница начала собирать материалы о серийном убийце из Алабамы, но и этот труд не был завершен.
В 2007 г. президент США Джордж Буш вручил Харпер Ли высшую гражданскую награду США - Президентскую медаль Свободы (за вклад в американскую литературу). В этом же году она перенесла инсульт.
В 2010 г. президент США Барак Обама наградил писательницу Национальной медалью "За вклад в искусство" (считается в США одной из самых почетных наград в гуманитарной сфере).
В 2016 г. стало известно, что по роману "Убить пересмешника" в театре на Бродвее в сезоне 2017-2018 гг. будет поставлен спектакль. Адаптация произведения для бродвейской сцены, по данным газеты "Уолл-стрит джорнэл", поручена сценаристу Аарону Соркину, известному по фильмам "Социальная сеть" (2010), "Стив Джобс" (2015) и телесериалам "Ночь спорта" (1998-2000), "Западное крыло" (1999-2006).
На 2016 г. общий тираж романа составляет более 30 млн экземпляров, он был переведен на 18 языков. На русском языке роман был опубликован в 1964 г. в переводе Норы Галь и Раисы Облонской. В США включен в школьную программу.
19 февраля 2016 г. Харпер Ли скончалась в возрасте 89 лет от повторного инсульта. Похоронена в Монровилле.
Замужем не была, детей не имела.