Родился 6 февраля 1961 г. в селе Рясное Золочевского района Харьковской области Украинской ССР (ныне Украина).
Выпускник Ейского высшего военного авиационного училища летчиков им. В. М. Комарова (1982). В 1992-1994 гг. прошел обучение в Международном центре обучающих систем при ЮНЕСКО (Москва), где получил квалификацию инженера-эколога и степень магистра экологического менеджмента. В 2007 г. окончил Военно-воздушную академию им. Ю. А. Гагарина.
Кандидат технических наук (2017, тема диссертации: "Повышение эффективности активной эксплуатации орбитальных пилотируемых комплексов на основе методик и моделей информационного обеспечения космических полетов и подготовки космонавтов по нештатным ситуациям").
В 1982-1989 гг. служил в Военно-воздушных силах СССР. С декабря 1982 г. - летчик, с мая 1983 г. - старший летчик 229 авиационного полка истребителей-бомбардировщиков Дальневосточного военного округа. С ноября 1984 г. был старшим летчиком 209 авиаполка ЗЗ авиационной дивизии истребителей-бомбардировщиков (Хабаровский край).
Военный летчик III класса, инструктор парашютно-десантной подготовки ВВС (1994). За время учебы и службы освоил самолеты Л-29, Су-7, Су-17 (общий налет - около 800 часов), выполнил 54 прыжка с парашютом.
22 апреля 1989 г. Юрий Онуфриенко был зачислен кандидатом в космонавты-испытатели в отряд Центра подготовки космонавтов (ЦПК) им. Ю. А. Гагарина. После прохождения курса общекосмической подготовки, в феврале 1991 г. ему была присвоена квалификация "космонавт-испытатель". В апреле 1991 г. он был назначен на должность космонавта-испытателя 1 группы отряда ЦПК.
Свой первый космический полет Юрий Онуфриенко выполнил 21 февраля - 2 сентября 1996 г. в качестве командира экипажа корабля "Союз ТМ-23" и 21-й основной экспедиции на российскую станцию "Мир". Работал на орбитальной станции с бортинженером Юрием Усачевым, а также с американкой специалистом полета Шеннон Люсид по программе "Мир-НАСА" (с марта) и француженкой космонавтом-исследователем Клоди-Андре Деэ по программе "Кассиопея" (с августа). За время полета Онуфриенко совершил шесть выходов в открытый космос.
В июне 1997 г. ему было присвоено звание полковника, и он был назначен инструктором-космонавтом-испытателем 1 группы отряда ЦПК. С июля 1999 г. одновременно занимал должность командира 1 группы отряда космонавтов.
Во второй раз Онуфриенко отправился в космос 6 декабря 2001 г. на американском шаттле Endeavour ("Индевор", миссия STS-108). Был командиром 4-й основной экспедиции на Международную космическую станцию (МКС), в состав экипажа также входили американские астронавты Карл Уолз и Дэниел Бёрш. Работая на МКС, Онуфриенко дважды выходил в открытый космос. 19 июня 2002 г. экипаж экспедиции МКС-4 возвратился на Землю на Endeavour (миссия STS-111).
В общей сложности за два полета Юрий Онуфриенко провел в космосе 389 суток 14 часов 46 минут, совершил восемь выходов в открытый космос (суммарное время - 42 часа 32 минуты).
17 марта 2004 г. он был отчислен из отряда космонавтов в связи с назначением на должность заместителя начальника 1-го управления Центра подготовки космонавтов. Впоследствии стал начальником 3-го управления ЦПК.
В 2009-2014 гг. - член Совета депутатов городского округа "Звездный городок" (Московская обл.), избирался в качестве самовыдвиженца.
Является членом правления межрегиональной общественной организации "Клуб Героев Советского Союза, Героев Российской Федерации и полных кавалеров ордена Славы г. Москвы и Московской области".
Герой РФ (1996). Награжден орденом "За заслуги перед Отечеством" IV степени (2004), медалями "За безупречную службу" I, II и III степеней, "За заслуги в освоении космоса" (2011), "Патриот России" (2014).
Лауреат премии правительства РФ имени Ю. А. Гагарина в области космической деятельности (2016, "за создание технологии многосегментной подготовки к полету экипажей международной космической станции").
Кавалер французского ордена Почетного легиона (1997).
Космонавт I класса (2002).
Летчик-космонавт РФ (1996).
Имеет медали "За космический полет", "За общественные заслуги" НАСА.