Родился 15 апреля 1966 г. в пос. Олымский (Касторенский район Курской области) в семье геолога. В детстве жил с родителями в пос. Билибино (Чукотский автономный округ) и г. Железноводске (Ставропольский край).
В 1985 г. Сергей Пускепалис окончил Саратовское театральное училище им. И. А. Слонова (ныне Театральный институт Саратовской государственной консерватории, академии, им. Л. В. Собинова). Выпускник курса народного артиста СССР Юрия Киселева.
В 1985-1988 гг. Сергей Пускепалис проходил срочную службу в Военно-морском флоте СССР (служил в Североморске). Вышел в запас в звании старшины первой статьи. Вернувшись в Саратов, более десяти лет работал актером в местном Театре юного зрителя.
В 2001 г. окончил в Москве режиссерский факультет Российской академии театрального искусства - ГИТИС (ныне Российский институт театрального искусства - ГИТИС). Руководителем курса был народный артист РФ профессор Петр Фоменко.
Получив профессиональное режиссерское образование, Сергей Пускепалис ставил спектакли в театрах Самары и Петропавловска-Камчатского. В 2003-2007 гг. являлся главным режиссером Магнитогорского драматического театра им. А. С. Пушкина. Среди его постановок: "Женитьба Фигаро" по комедии Бомарше, "Сирена и Виктория" по произведению Александра Галина, "Блин-2" по пьесе Алексея Слаповского, "Любовь к ближнему" по произведению Леонида Андреева. Также он преподавал на театральном факультете Магнитогорской государственной консерватории им. М. И. Глинки.
В 2007 г. в Московском театре Олега Табакова инсценировал пьесу Александра Островского и Николая Соловьева "Женитьба Белугина". В 2009 г. в Московском театре "Современник" поставил спектакль "Бог резни" по трагикомедии Ясмины Реза.
В 2009-2010 гг. Сергей Пускепалис был главным режиссером Российского государственного академического театра драмы им. Ф. Волкова (Ярославль). Поставил на его сцене спектакли "С любимыми не расставайтесь" по пьесе Александра Володина и "Три сестры" по произведению Антона Чехова.
В 2011-2013 гг. сотрудничал с Московским художественным академическим театром им. А. П. Чехова. Поставил в нем спектакль "Дом" по пьесе Евгения Гришковца и Анны Матисон, а также "Прошлым летом в Чулимске" по произведению Александра Вампилова.
С декабря 2018 г. по август 2019 г. был заместителем художественного руководителя МХАТ им. М. Горького по творческой работе. В 2019 г. инсценировал в этом театре повесть Валентина Распутина "Последний срок". Являлся режиссером МХАТ им. М. Горького.
Весной 2019 г. представил в Московском театре Олега Табакова спектакль "Русская война Пекторалиса" по мотивам повести Николая Лескова "Железная воля".
С августа 2019 г. по сентябрь 2022 г. Сергей Пускепалис работал художественным руководителем Российского государственного академического театра драмы им. Федора Волкова в Ярославле. Поставил в нем спектакли "Забыть Герострата!" по трагикомедии Григория Горина, "Предстоящее событие" по комедийной пьесе Игоря Глинкова и "Весы" по произведению Евгения Гришковца.
Сергей Пускепалис дебютировал в кино в эпизодической роли в мелодраме Алексея Учителя "Прогулка" (2003). Среди наиболее известных киноработ: врач Сергей Маслов в драме "Простые вещи" (2006, режиссер Алексей Попогребский), начальник полярной станции Сергей Гулыбин в фильме "Как я провел этим летом" (2010, Алексей Попогребский), капитан Иван Греков в сериале "Жизнь и судьба" по мотивам романа Василия Гроссмана (2012, Сергей Урсуляк), Андрей Гарин в фильме-катастрофе "Метро" (2012, Антон Мегердичев), Владимир Каленый в сериале "А у нас во дворе…" (2012-2017, телепремьера - 2017, Ольга Музалева), капитан научно-исследовательского судна Валентин Севченко в драме "Ледокол" (2016, Николай Хомерики), сотрудник правоохранительных органов Константин Проскурин в детективном сериале "Шифр-2" (2020, Вера Сторожева). В общей сложности снялся в более чем тридцати фильмах и сериалах.
В 2015 г. Сергей Пускепалис дебютировал в качестве кинорежиссера, поставив драму "Клинч" по пьесе Алексея Слаповского. Являлся соучредителем кинокомпании "Кедр про".
Сергей Пускепалис погиб 20 сентября 2022 г. на 57-м году жизни в дорожно-транспортном происшествии в Ростовском районе Ярославской области. ДТП произошло на 201-м км автодороги М8 "Холмогоры". Пускепалис с водителем перегоняли бронированный микроавтобус для военных Донбасса. Водитель также погиб. Сергей Пускепалис похоронен в Железноводске.
Был членом Национальной академии кинематографических искусств и наук России, Российской академии кинематографических искусств "Ника". Входил в состав совета по культуре при Федеральной службе войск национальной гвардии РФ.
Являлся соучредителем Всероссийского общественного движения наставников детей и молодежи "Наставники России", Благотворительного фонда поддержки и развития театра им. Федора Волкова.
В феврале 2020 г. Сергей Пускепалис был избран заместителем председателя партии "За правду" Захара Прилепина. В феврале 2021 г. вошел в состав центрального совета партии "Справедливая Россия - Патриоты - За правду" (ранее существовавшие партии "За правду" и "Патриоты России" тогда же были ликвидированы). В августе 2021 г. стал доверенным лицом этой партии на выборах в Госдуму РФ VIII созыва.
Заслуженный артист РФ (1999).
Посмертно награжден орденом Мужества (2023).
За роль в фильме "Простые вещи" был удостоен приза кинофестиваля "Кинотавр" в номинации "Лучшая мужская роль" (2007) и приза кинофестиваля в Карловых Варах (Чехия) в аналогичной категории, а также премии "Ника" в номинации "Открытие года" (2008). В 2010 г. вместе с партнером по фильму "Как я провел этим летом" Григорием Добрыгиным получил приз "Серебряный медведь" за лучшую мужскую роль Берлинского кинофестиваля (Германия). Лауреат кинопремии "Золотой орел" в номинации "Лучшая мужская роль на телевидении" (2018, "А у нас во дворе…").