Родилась 9 февраля 1960 г. в г. Маунт Эр (штат Айова, США).
В 1981 г. получила степень бакалавра в области биологии и химии в колледже Веслейн (штат Айова), в 1985 г. - степень доктора в области биохимии в Университете Райса (г. Хьюстон, штат Техас).
В 1986 г. стала членом Национального исследовательского совета США и была прикомандирована к Центру космических исследований им. Линдона Джонсона в Хьюстоне (штат Техас).
В 1988-1989 гг. являлась научным руководителем исследовательской группы по биохимии в компании KRUG International, которая осуществляла медико-биологические исследования по заказу Национального управления США по аэронавтике и исследованию космического пространства (НАСА).
В 1989-1993 гг. работала биохимиком-исследователем в отделении биомедицинских операций и исследований Центра космических исследований им. Линдона Джонсона. В 1993-1996 гг. была заместителем начальника отделения медицинских наук Центра.
С 1992 по 1995 г. - руководитель исследований по программе "Мир - Шаттл", в рамках которой осуществлялись полеты американских шаттлов на российскую станцию "Мир". В 1995-1996 гг. - сопредседатель советско-американской рабочей группы по научной программе.
Одновременно в 1991-1997 гг. была адъюнктом (помощником профессора) на кафедре медицины, затем на кафедре биохимии и генетики медицинского отделения Университета Техаса в Галвестоне. С 1997 г. - адъюнкт на кафедре биохимии и генной инженерии Мейбеевской лаборатории Университета Райса.
В апреле 1996 г. Пегги Уитсон была отобрана кандидатом в астронавты НАСА. После двухгодичного курса общекосмической подготовки в 1998 г. получила квалификацию специалиста полета. Затем работала в отделении оперативного планирования отдела астронавтов. В 2003-2005 гг. занимала должность заместителя начальника отдела астронавтов, с мая по ноябрь 2005 г. была начальником отделения по операциям на МКС отдела астронавтов. С октября 2009 г. по июль 2012 г. возглавляла отряд астронавтов НАСА.
Свой первый полет в космос Пегги Уитсон совершила 5 июня - 7 декабря 2002 г. в составе экипажа американского шаттла Endeavour ("Индевор"). Была бортинженером и научным специалистом 5-й основной экспедиции на Международную космическую станцию (МКС). Выполнила один выход в открытый космос.
Второй полет состоялся 10 октября 2007 г. - 19 апреля 2008 г. в качестве бортинженера российского корабля "Союз ТМА-11" и командира основной экспедиции МКС-16. Уитсон пять раз выходила в открытый космос с борта станции.
В третий раз Пегги Уитсон отправилась в полет 17 ноября 2016 г. на корабле "Союз МС-03" в составе очередной основной экспедиции на МКС. Согласно первоначальным планам, она должна была вернуться на Землю в июне 2017 г., однако по договоренности НАСА с Роскосмосом ее полет был продлен. Была бортинженером 50-й и 52-й экспедиций, командиром 51-й экспедиции. За время полета Уитсон четыре раза выходила в открытый космос. Вернулась на Землю 3 сентября 2017 г. на "Союзе МС-04". Всего она провела в космосе 289 суток 5 часов 1 минуту, что стало новым рекордом среди женщин по продолжительности одного полета. Это первенство Пегги Уитсон удерживала более двух лет. В феврале 2020 г. Уитсон превзошла вернувшаяся с орбиты астронавт НАСА Кристина Кук, она работала на МКС с марта 2019 г. и налетала 328 суток 14 часов.
В июне 2018 г. Пегги Уитсон завершила карьеру астронавта и ушла из НАСА.
22-31 мая 2023 г. она совершила полет на МКС в качестве командира коммерческой миссии Axiom 2 ("Аксиом-2") на корабле Crew Dragon ("Крю дрэгон").
Пегги Уитсон - абсолютный рекордсмен среди женщин по суммарной продолжительности орбитальных полетов и по общему времени работы в открытом космосе. За четыре полета она налетала около 675 дней 3 часа 50 минут. На ее счету 10 выходов в открытый космос суммарной продолжительностью 60 часов 19 минут.
Награждена медалями НАСА "За космический полет" (2002, 2008) и "За исключительные заслуги" (1995, 2003, 2006, 2008), российской медалью "За заслуги в освоении космоса" (2011) и др.
Замужем.